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【技術(shù)在線】使用Cygnus ELISA試劑盒該如何設(shè)置空白對(duì)照？

空白對(duì)照的定義及其在ELISA測(cè)定中的應(yīng)用 空白對(duì)照是指在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中設(shè)置的一種陰性對(duì)照，旨在監(jiān)測(cè)非特異性背景信號(hào)，并為基線吸光度值提供參考。在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）中，通過(guò)引入空白對(duì)照，可以有效識(shí)別并扣除樣品讀數(shù)中的背景噪聲，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。然而，在多分析物ELISA測(cè)定中，由于其固有的高背景信號(hào)特性，這種標(biāo)準(zhǔn)化方法可能并不適用。本文將詳細(xì)探討為何在Cygnus的ELISA測(cè)定中通常不建議使用空白對(duì)照。 減去背景值對(duì)多分析物ELISA檢測(cè)結(jié)果的影響 在多分析物ELISA測(cè)定中，如HCP ELISA，由于HCP抗體的復(fù)雜性，其背景信號(hào)通常較高。這使得此類檢測(cè)的基線吸光度值（OD值）普遍高于簡(jiǎn)單的單分析物檢測(cè)。從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來(lái)看，從樣品讀數(shù)中減去較高的基線OD值可能會(huì)增加數(shù)據(jù)的變異程度，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。 以下示例說(shuō)明了背景值扣除對(duì)變異系數(shù)的影響。在表1中，標(biāo)準(zhǔn)A的平均OD值為0.100，標(biāo)準(zhǔn)B的平均OD值為0.150 。當(dāng)通過(guò)原始讀數(shù)減去空白對(duì)照的OD值來(lái)計(jì)算變異系數(shù)（CV）時(shí)，CV值顯著上升，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)B的CV%從6.7%增加至20%。 表1. 背景值扣除對(duì)變異系數(shù)的影響 檢測(cè)背景值越高，對(duì)變異系數(shù)百分比的影響就越大。 表2展示了8種不同ELISA試劑盒在10組隨機(jī)數(shù)據(jù)集中的平均變異系數(shù)（CV%）?；谠糘D值計(jì)算得出的CV%范圍為10%至20%，而經(jīng)過(guò)空白對(duì)照校正后的相同數(shù)據(jù)CV%則超過(guò)了20%。在所有情況下，經(jīng)過(guò)空白對(duì)照校正后的CV%均高于未校正的數(shù)據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用中，分析數(shù)據(jù)放行的標(biāo)準(zhǔn)通常要求重復(fù)檢測(cè)的CV%不超過(guò)20%，上述差異可能直接導(dǎo)致分析結(jié)果無(wú)法滿足精密度要求，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，引入空白對(duì)照將直接導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果無(wú)法符合放行要求。表2. 經(jīng)過(guò)空白對(duì)照校正后的CV%與未校正數(shù)據(jù)的CV%值對(duì)比 從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來(lái)看，空白對(duì)照的OD值越高，出現(xiàn)此類問(wèn)題的可能性就越大。 鑒于上述原因，Cygnus Technologies 致力于開發(fā)和提供無(wú)需背景校正的 ELISA 試劑盒。在我們已上市的 ELISA 試劑盒開發(fā)、分析及測(cè)試過(guò)程中，從未在批次放行的工作流程中引入空白對(duì)照校正步驟。相反，我們使用 0 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)設(shè)定 Y 軸截距并確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的下限。因此，如果您在實(shí)驗(yàn)流程中加入了空白對(duì)照校正步驟，其獲得的檢測(cè)變異系數(shù)（CV）百分比很可能會(huì)高于 Cygnus 質(zhì)控團(tuán)隊(duì)所記錄的結(jié)果。Cygnus針對(duì)每一種檢測(cè)試劑盒均提供相應(yīng)的QS（Qualification Summary）文件，如有需求歡迎點(diǎn)擊這里填寫信息索取，或直接聯(lián)系Cygnus中國(guó)總代理西美杰。如您在使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的過(guò)程中遇到任何問(wèn)題，我們的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)將竭誠(chéng)為您提供解決方案和建議。Cygnus Technologies專注為生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法超過(guò)25年，旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量。Cygnus開發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒，用于檢測(cè)超過(guò)50種不同表達(dá)系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專注于生物技術(shù)應(yīng)用免疫檢測(cè)的高靈敏度分析技術(shù)的專家，其產(chǎn)品和服務(wù)已經(jīng)被全球超過(guò)95%以上生物制藥公司使用，并獲得FDA、NMPA、EMA等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的廣泛認(rèn)可。北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國(guó)總代理，與國(guó)內(nèi)眾多知名藥企，CRO/CMO企業(yè)建立了長(zhǎng)久穩(wěn)定的合作關(guān)系。多年來(lái)西美杰的產(chǎn)品及服務(wù)幫助許多企業(yè)加速R&D階段，提高藥物質(zhì)量、純度和安全，加速優(yōu)化研發(fā)工藝，減少產(chǎn)品上市時(shí)間，降低QC成本。如您對(duì)上述產(chǎn)品感興趣，歡迎致電西美杰客服熱線400-050-4006或者登陸網(wǎng)站www.ahfanchi.com了解更多信息。 更多>

星品推薦 | 人血白蛋白穩(wěn)定劑

血液制品又稱血漿衍生物，英文名稱為Plasma Derivatives，是指從血漿中8%的血漿蛋白中分離提純得到的物質(zhì)。血漿蛋白由60%的白蛋白、15%的免疫球蛋白、4%的凝血因子和21%的其他蛋白成分組成。從不同的血漿蛋白成分中能夠提取出不同種類的血液制品。 白蛋白作為血漿衍生物中的代表性產(chǎn)品，是維持血漿膠體滲透壓的主要來(lái)源，具有調(diào)節(jié)血管內(nèi)外液體平衡以及維持血容量的作用。在臨床上，白蛋白主要用于失血?jiǎng)?chuàng)傷和燒傷等引起的休克、腦水腫，以及肝硬化、腎病引起的水腫或腹水等危重病癥的治療，以及低蛋白血癥患者?；诎椎鞍自谂R床上發(fā)揮的重要作用，中國(guó)、歐洲等藥典都對(duì)其有詳細(xì)描述如下： 藥典 章節(jié) 定義 中國(guó)藥典2020版 三部 245頁(yè) 本品系由健康人血漿，經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法或經(jīng)批準(zhǔn)的其他分離法分離純化，并經(jīng)60℃10小時(shí)加溫滅活病毒后制成。制品中應(yīng)加適量的穩(wěn)定劑，按每1g蛋白質(zhì)加入0.16mmol辛酸鈉或0.08mmol辛酸鈉和0.08mmol乙酰色氨酸鈉。 Ph. Eur. 2020 10th Volume 2, Page 2082 Sterile liquid preparation of a plasma protein fraction containing human albumin. It is obtained from plasma that complies with the monograph Human plasma for fractionation (0853). The preparation may contain excipients such as sodium caprylate (sodium octanoate) or N-acetyl tryptophan or a combination of the two. Ph.USP 2023 (USP46-NF41) Albumin Human Albumin Human is a sterile nonpyrogenic preparation of serum albumin obtained by fractionating merial (source blood, plasma, serum, orlacentas)from healthy human donors, the source materiabeing tested for the absence of hepatitis B surface antigen. lt is a solution containing, in each 100 mL. lt contains no added antimicrobial agent, but maycontain sodium acetyl tryptophanate with or without sodium caprylate as a stabilizing agent. 從各國(guó)藥典對(duì)成品白蛋白的定義中可以看出，在白蛋白制劑中有兩個(gè)非常重要的成分，分別是辛酸鈉和N-乙酰色氨酸。這兩種化學(xué)成分在白蛋白制劑中發(fā)揮著無(wú)可替代的重要作用，包括： 蛋白穩(wěn)定劑： 防止蛋白質(zhì)聚集和凝集 抑制微生物生長(zhǎng) 提高貯存期的穩(wěn)定性 此外，在其他生物制品生產(chǎn)過(guò)程中，辛酸鈉和N-乙酰色氨酸的應(yīng)用也十分廣泛。例如，在菌種特殊選育過(guò)程中，辛酸鈉可被用作培養(yǎng)基中的添加劑，以改善菌種的生長(zhǎng)和目標(biāo)蛋白的表達(dá)特性；有機(jī)化學(xué)基礎(chǔ)研究中，辛酸鈉可以用作一種添加劑或催化劑。在生物醫(yī)學(xué)研究中，N-乙酰-DL-色氨酸被廣泛用于構(gòu)建蛋白質(zhì)微泡，在造影成像、靶向藥物遞送、基因治療等方面發(fā)揮重要作用，尤其在跨越血腦屏障遞送藥物方面具有潛力。在實(shí)驗(yàn)室研究中，N-乙酰-DL-色氨酸可用于識(shí)別細(xì)菌菌株的診斷工具。為了滿足白蛋白成品對(duì)高品質(zhì)原料的需求，AppliChem將辛酸鈉和N-乙酰色氨酸全面升級(jí)為低內(nèi)毒素原料級(jí)別，符合多國(guó)藥典。產(chǎn)品詳情如下表。 貨號(hào) 品名 規(guī)格 CAS 636454 Sodium Caprylate (USP-NF, BP, Ph. Eur., ChP) low endotoxin, IPEC grade 辛酸鈉 10kg/25kg 1984-06-1 637763 N-Acetyl-DL-Tryptophan (Ph. Eur, BP) low endotoxin, pharma grade N-乙酰-DL-色氨酸 5kg/25kg 87-32-1 產(chǎn)品特點(diǎn)： 符合Ph. Eur、USP、BP、ChP多國(guó)藥典· 高純度，低內(nèi)毒素，低金屬雜質(zhì)殘留· 符合ICH Q3D標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)24種金屬離子殘留進(jìn)行檢測(cè) 截至目前，AppliChem的辛酸鈉和N-乙酰色氨酸已在國(guó)際上數(shù)個(gè)白蛋白和其他生物制藥相關(guān)項(xiàng)目中被廣泛使用。 除了辛酸鈉和N-乙酰色氨酸， Applichem還提供其他與血漿衍生物相關(guān)的產(chǎn)品，詳情如下。如有興趣，請(qǐng)聯(lián)系A(chǔ)ppliChem的中國(guó)總代理西美杰獲取更多信息。。 貨號(hào) 品名 規(guī)格 CAS號(hào) 63B764 6-Aminohexanoic Acid (Ph. Eur., BP, USP) IPEC grade 6-氨基己酸 5 kg 60-32-2 631632 Sodium Acetate 3-hydrate (Ph. Eur, BP, USP) IPEC grade三水合醋酸鈉 5 kg/25 kg 6131-90-4 西美杰是PanReac AppliChem中國(guó)總代理，為用戶提供完善的技術(shù)支持與售后服務(wù)。如對(duì)產(chǎn)品感興趣歡迎撥打西美杰客服熱線400-050-4006或登錄網(wǎng)站www.ahfanchi.com了解更多信息。 更多>

新年又添喜訊！Pfanstiehl 注射級(jí)L-組氨酸 (H-116) CDE登記號(hào)已激活轉(zhuǎn)A！

“ 熱烈祝賀Pfanstiehl品牌注射級(jí)組氨酸H-116 CDE注冊(cè)登記號(hào)F20200000338已激活！”Pfanstiehl新年喜訊頻傳，繼注射級(jí)精氨酸才激活之際，注射級(jí)組氨酸H-116 CDE登記號(hào)F20200000338在千呼萬(wàn)喚中也終于激活轉(zhuǎn)A了。Pfanstiehl品牌注射級(jí)組氨酸H-116，于2020年推出之際，便秉承一貫高品質(zhì)理念，具有超高純度，超低內(nèi)毒素，超低金屬殘留的特點(diǎn)，單獨(dú)檢測(cè)29種金屬離子，符合多國(guó)藥典規(guī)定（USP, EP, JPE, ChP），可用于生物治療性藥物和疫苗的生產(chǎn)。Pfanstiehl 注射級(jí)組氨酸將于2025年3月再一次全面提升質(zhì)量指標(biāo)，進(jìn)一步縮窄29種金屬離子的質(zhì)控指標(biāo)，低至ppb水平；并根據(jù)FDA和EMA關(guān)于亞硝酸鹽的指南，新增10種亞硝酸鹽的質(zhì)控；并加入DNA，RNA，DNA酶，RNA酶和脂肪酶，磷酸酶，蛋白酶等各種酶類的控制，進(jìn)一步降低可能由組氨酸引入的對(duì)蛋白穩(wěn)定性和對(duì)其他輔料如吐溫降解的負(fù)面影響。產(chǎn)品信息： · 產(chǎn)品名稱: L-Histidine, High Purity, Low Endotoxin, Low Metals, USP, EP, BP, JP, ChP (H-116)· 中文名稱：L-組氨酸· 分子式：C6H9N3O2· 分子量：155.15g / mol· CAS號(hào)：71-00-1· 產(chǎn)品貨號(hào)：H-116產(chǎn)品特點(diǎn)：· 超高純度，超低內(nèi)毒素，超低微生物含量，超低金屬雜質(zhì)殘留· 質(zhì)量指標(biāo)新增DNA，RNA，DNA酶，RNA酶，脂肪酶和亞硝酸鹽檢測(cè)· 符合多國(guó)藥典：USP, EP, BP,JPE,ChP· 符合ICH Q3D標(biāo)準(zhǔn)· 符合GMP標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品應(yīng)用：· 緩沖液如果您對(duì)Pfanstiehl的注射級(jí)L-組氨酸H-116 感興趣，可聯(lián)系Pfanstiehl中國(guó)區(qū)代理北京西美杰科技有限公司獲得詳細(xì)的產(chǎn)品概況說(shuō)明文件如下。也歡迎聯(lián)系獲取測(cè)試樣品。Pfanstiehl Inc.產(chǎn)品系列如下，歡迎聯(lián)系北京西美杰科技有限公司獲取100g裝免費(fèi)樣品。 北京西美杰科技有限公司為Pfanstiehl中國(guó)代理，為客戶提供完善的技術(shù)支持與售后服務(wù)。歡迎撥打西美杰客服電話400-050-4006或者登陸網(wǎng)站www.ahfanchi.com了解更多信息。 更多>

Cygnus HCPs親和純化抗體申購(gòu)指南

Cygnus HCPs親和純化抗體申購(gòu)指南為了更好地滿足抗體覆蓋率驗(yàn)證的多樣化需求，Cygnus公司限量提供與HCPs ELISA試劑盒匹配的HCPs親和純化抗體，包括生物素標(biāo)記親和純化抗體、HRP標(biāo)記親和純化抗體等多種類型，抗體查詢請(qǐng)點(diǎn)擊這里。 所有用戶在申購(gòu)HCPs親和純化抗體前，必須按照實(shí)際應(yīng)用需求填寫《Cygnus HCPs親和純化抗體申購(gòu)表》，通過(guò)Cygnus審核后方可獲取報(bào)價(jià)并購(gòu)買。具體申購(gòu)流程如下： 掃碼下方二維碼，即刻填寫《Cygnus HCPs親和純化抗體申購(gòu)表》注意事項(xiàng)：報(bào)價(jià)號(hào)只能使用一次，下單后失效，再次購(gòu)買抗體需要重新填寫申購(gòu)表獲取報(bào)價(jià)，請(qǐng)準(zhǔn)確填寫表中要求的所有信息。如果您有任何疑問(wèn)，歡迎聯(lián)系Cygnus中國(guó)區(qū)總代理北京西美杰科技有限公司。希望以上信息能幫助您順利購(gòu)買到Cygnus Technologies親和純化抗體產(chǎn)品。Cygnus Technologies專注為生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法超過(guò)25年，旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量。Cygnus開發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒，用于檢測(cè)超過(guò)50種不同表達(dá)系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專注于生物技術(shù)應(yīng)用免疫檢測(cè)的高靈敏度分析技術(shù)的專家，其產(chǎn)品和服務(wù)已經(jīng)被全球超過(guò)95%以上生物制藥公司使用，并獲得FDA、NMPA、EMA等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的廣泛認(rèn)可。 北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國(guó)總代理，與國(guó)內(nèi)眾多知名藥企，CRO/CMO企業(yè)建立了長(zhǎng)久穩(wěn)定的合作關(guān)系。多年來(lái)西美杰的產(chǎn)品及服務(wù)幫助許多企業(yè)加速R&D階段，提高藥物質(zhì)量、純度和安全，加速優(yōu)化研發(fā)工藝，減少產(chǎn)品上市時(shí)間，降低QC成本。如您對(duì)上述產(chǎn)品感興趣，歡迎致電西美杰客服熱線400-050-4006或者登陸網(wǎng)站www.ahfanchi.com了解更多信息。 更多>

喜大普奔！Pfanstiehl 注射級(jí)L-精氨酸 (A-170) CDE登記號(hào)已激活！

“ 熱烈祝賀Pfanstiehl品牌注射級(jí)精氨酸A-170 CDE注冊(cè)登記號(hào)F20190000412已激活！”Pfanstiehl新年喜訊頻傳，注射級(jí)精氨酸A-170 CDE登記號(hào)F20190000412激活了。Pfanstiehl品牌注射級(jí)精氨酸A-170，秉承一貫高品質(zhì)理念，具有超高純度，超低內(nèi)毒素，超低金屬殘留的特點(diǎn)，單獨(dú)檢測(cè)29種金屬離子，并且新增DNA，RNA，DNA酶，RNA酶和脂肪酶，亞硝酸鹽等多項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)的檢測(cè)，符合多國(guó)藥典規(guī)定（USP, EP, JPE, ChP），可用于生物治療性藥物和疫苗的生產(chǎn)。產(chǎn)品信息： · 產(chǎn)品名稱: L-Arginine, High Purity, Low Endotoxin, Low Metals, USP,EP, JP, ChP (A-170)· 中文名稱：L-精氨酸· 分子式：C6H14N4O2· 分子量：174.20 g / mo· CAS號(hào)：74-79-3· 產(chǎn)品貨號(hào)：A-170產(chǎn)品特點(diǎn)：· 超高純度，超低內(nèi)毒素，超低微生物含量，超低金屬雜質(zhì)殘留· 質(zhì)量指標(biāo)新增DNA，RNA，DNA酶，RNA酶，脂肪酶和亞硝酸鹽檢測(cè)· 符合多國(guó)藥典：USP, EP, JPE, ChP· 符合ICH Q3D標(biāo)準(zhǔn)· 符合GMP標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品應(yīng)用：· 緩沖液· 降粘 如果您對(duì)Pfanstiehl的注射級(jí)L-精氨酸A-170 感興趣，可聯(lián)系Pfanstiehl中國(guó)區(qū)代理北京西美杰科技有限公司獲得詳細(xì)的產(chǎn)品概況說(shuō)明文件如下。也歡迎聯(lián)系獲取測(cè)試樣品。Pfanstiehl Inc.產(chǎn)品系列如下，歡迎聯(lián)系北京西美杰科技有限公司 獲取100g裝免費(fèi)樣品。 北京西美杰科技有限公司為Pfanstiehl中國(guó)代理，為客戶提供完善的技術(shù)支持與售后服務(wù)。歡迎撥打西美杰客服電話400-050-4006或者登陸網(wǎng)站www.ahfanchi.com了解更多信息。 更多>

抗體片段捕獲的利器---Fabsorbent? F1P HF親和層析填料

近年來(lái)，抗體和抗體片段在生物大分子治療和診斷領(lǐng)域備受關(guān)注，很多抗體類藥物已經(jīng)步入商業(yè)化生產(chǎn)階段。相較于完整的抗體，抗體片段分子量低，組織滲透性好，少有復(fù)雜的糖基化結(jié)構(gòu)，可以使用多種原核或真核細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)進(jìn)行表達(dá)，已成為很多生物技術(shù)公司的研究熱點(diǎn)。與完整的抗體不同，很多抗體片段分子結(jié)構(gòu)中沒有Fc端，無(wú)法用傳統(tǒng)的Protein A親和層析填料進(jìn)行捕獲，而Protein L親和層析填料，由于可以結(jié)合抗體輕鏈的可變區(qū)域，為抗體片段的捕獲提供了可靠的技術(shù)手段。但市面上常見的Protein L親和層析填料穩(wěn)定性普遍較低，填料無(wú)法耐受高濃度堿液的清潔，配基脫落嚴(yán)重，且價(jià)格昂貴，給純化工藝帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。 FabsorbentTM F1P HF是Astrea Bioseparations公司近年來(lái)推出的親和層析填料，填料基架是粒徑均一的高交聯(lián)瓊脂糖，基架上修飾有化學(xué)合成的小分子配基，可以高效捕獲各種抗體片段分子。相較于Protein L親和層析填料，F(xiàn)absorbentTM F1P HF的結(jié)合范圍更廣泛，填料可以耐受高達(dá)1M NaOH的清潔，其主要優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)歸納如下： 結(jié)合范圍廣，既可以結(jié)合kappa型輕鏈，也可以結(jié)合lambda型輕鏈，對(duì)一些非人源性的抗體（如鼠源性、牛源性、羊源性等）也有一定的結(jié)合能力，可廣泛地用于F(ab’)2, Fab, scFv, VL, IgG的捕獲。 小分子化學(xué)合成配基，無(wú)動(dòng)物源性，穩(wěn)定性好，安全性高。 填料可以耐受0.5-1M NaOH的清潔和消毒，清潔效果好，壽命長(zhǎng)。 應(yīng)用案例1：FabsorbentTM F1P HF捕獲F(ab’)2抗體片段 在該測(cè)試案例中，研究人員使用胃蛋白酶將完整的IgG水解為Fc和F(ab’)2片段，并上樣到FabsorbentTM F1P HF層析柱中，工藝參數(shù)如下表所示： 層析柱： CV=10mL 層析填料： FabsorbentTM F1P HF 流速： 250cm/h 平衡液： 25mM Tris-HCl, pH 8.0 洗脫液： 50mM sodium citrate, pH 3.0 清潔： 0.5M NaOH 由圖1的層析圖譜和圖2的SDS-PAGE電泳圖譜可以看出，F(xiàn)absorbentTM F1P HF可以高效捕獲料液中的F(ab’)2片段，經(jīng)洗脫后，得到高純度的F(ab’)2分子，層析前添加的胃蛋白酶可被有效去除。 圖1：FabsorbentTM F1P HF捕獲F(ab’)2的層析圖譜 圖2：SDS-PAGE電泳圖譜（Lane 1是molecular weight marker；Lane 2是IgG標(biāo)準(zhǔn)品；Lane 3是胃蛋白酶水解后料液；Lane 4是流穿和淋洗液；Lane 5是洗脫液。） 應(yīng)用案例2：FabsorbentTM F1P HF捕獲CHO表達(dá)的Fab抗體片段 在該應(yīng)用案例中，研究人員使用CHO細(xì)胞表達(dá)Fab抗體片段，細(xì)胞收獲液經(jīng)澄清后，上樣到FabsorbentTM F1P HF層析柱中，工藝參數(shù)如下表所示： 層析柱： 10mm×5cm，CV=4mL 層析填料： FabsorbentTM F1P HF 流速： 300cm/h，上樣流速50cm/h 平衡液： 50mM sodium phosphate, pH 8.0 上樣： 澄清后的CHO細(xì)胞收獲液（含F(xiàn)ab），pH 8.0 洗脫液（測(cè)試1）： 50mM sodium citrate, pH 3.0 洗脫液（測(cè)試2）： 50mM sodium acetate, pH 4.0 淋洗液（測(cè)試3）： 50mM glycine-NaOH, pH 9.0 洗脫液（測(cè)試3）： 50mM sodium acetate, pH 4.0 清潔： 0.5M NaOH 測(cè)試還研究了不同的洗脫工藝條件，測(cè)試1采用了pH 3.0的等度洗脫方式，測(cè)試2采用了pH 4.0的等度洗脫方式，測(cè)試3先采用pH 9.0的甘氨酸緩沖液進(jìn)行上樣后的淋洗，隨后用pH 4.0的醋酸鹽緩沖液進(jìn)行等度洗脫。 由圖4的SDS-PAGE電泳圖譜可以看出，F(xiàn)absorbentTM F1P HF可以有效捕獲細(xì)胞收獲液中的Fab抗體片段。三種洗脫方式均可以確保大于90%的目標(biāo)Fab純度，且回收率極高。其中，在測(cè)試2的洗脫條件下，F(xiàn)ab純度和回收率最高。在測(cè)試3的條件下，洗脫前使用pH 9.0的甘氨酸緩沖液淋洗能去除少量非特異性結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。 圖3：FabsorbentTM F1P HF捕獲Fab的層析圖譜（測(cè)試2） 圖4：SDS-PAGE電泳圖譜（Lane 1是molecular weight marker；Lane 2是純化后的Fab對(duì)照品；Lane 3澄清后的CHO細(xì)胞收獲液；Lane 4是測(cè)試1的流穿液；Lane 5是測(cè)試1 的洗脫液；Lane 6是測(cè)試2的流穿液；Lane 7是測(cè)試2的洗脫液；Lane 8是測(cè)試2的再生液（citrate, pH 3.0）；Lane 9是測(cè)試3的流穿液；Lane 10是測(cè)試3的淋洗液；Lane 11是測(cè)試3的洗脫液。） 應(yīng)用案例3： FabsorbentTM F1P HF捕獲E.coli表達(dá)的VL抗體片段 在該應(yīng)用案例中，研究人員使用E.coli表達(dá)VL抗體片段，經(jīng)細(xì)胞裂解和澄清后，直接上樣到FabsorbentTM F1P HF層析柱中，工藝參數(shù)如下表所示： 層析柱： CV=1mL 層析填料： FabsorbentTM F1P HF 流速： 保留時(shí)間=3min 平衡液： 25mM Tris-HCl, pH 9.0 洗脫液： 50mM sodium citrate, pH 3.0 清潔： 0.5M NaOH 由圖5的層析圖譜和圖6的SDS-PAGE電泳圖譜可以看出，F(xiàn)absorbentTM F1P HF可以有效捕獲復(fù)雜料液中的VL抗體片段，大量雜質(zhì)蛋白在上樣和淋洗過(guò)程中被去除，經(jīng)洗脫后，可以得到純度極高的目標(biāo)分子VL。 圖5：FabsorbentTM F1P HF捕獲VL的層析圖譜 圖6：SDS-PAGE電泳圖譜（Lane 1是molecular weight marker；Lane 2是澄清后的E.coli裂解液；Lane 3是流穿液；Lane 4是淋洗液；Lane 5是洗脫液；Lane 6是清潔液。） FabsorbentTM F1P HF親和層析填料的技術(shù)參數(shù) 配基： 化學(xué)合成的三嗪類配基 基架： 粒徑均一的高交聯(lián)瓊脂糖（PuraBead® 6HF） 平均粒徑： 90±10µm 結(jié)合載量： Human Fab: 20mg/ml adsorbent Human IgG: ≥40mg/ml adsorbent 操作流速： up to 500cm/h pH穩(wěn)定性： 3-13（三個(gè)月以上的長(zhǎng)期測(cè)試數(shù)據(jù)） 清潔/消毒： 0.5-1M NaOH, 25℃ 保存： 20%乙醇，2-30℃ FabsorbentTM F1P HF親和層析填料產(chǎn)品信息 散裝填料 貨號(hào) 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 3904-00025 FabsorbentTM F1P HF 25 mL 3904-00100 FabsorbentTM F1P HF 100 mL 3904-00500 FabsorbentTM F1P HF 500 mL 3904-01000 FabsorbentTM F1P HF 1 L 預(yù)裝柱 貨號(hào) 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 6632 FabsorbentTM F1P HF Column Kit, 4 x 1 ml 4 x 1 ml預(yù)裝柱 6633 FabsorbentTM F1P HF Column Kit, 4 x 5 ml 4 x 5 ml預(yù)裝柱 2233 FabsorbentTM F1P HF PuraPlate 96孔板 參考資料： S. Kittler et al., Protein L-more than just an affinity ligand, 2021 Brochure: Purify and capture of antibody fragments with a new synthetic ligand affinity adsorbent FabsorbentTM F1P HF, Astrea Bioseparations Technical Note: Fab and F(ab’)2 fragment purification from CHO cell culture supernatant using Fabsorbent? F1P HF, Astrea Bioseparations Technical User Guide: FabsorbentTM F1P HF, Astrea Bioseparations Astrea Bioseparations于1987年孵化自劍橋大學(xué)，擁有超過(guò)30年層析介質(zhì)研發(fā)和生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，是世界級(jí)層析介質(zhì)產(chǎn)品與服務(wù)供應(yīng)商。目前使用Astrea的產(chǎn)品已有超過(guò)21個(gè)生產(chǎn)工藝通過(guò)了FDA和EMA的批準(zhǔn)。Astrea Bioseparations在全球擁有3個(gè)研發(fā)和生產(chǎn)基地，專注為生物大分子和CGT領(lǐng)域提供行業(yè)領(lǐng)先的層析介質(zhì)和技術(shù)服務(wù)。Astrea Bioseparations推出的基于納米纖維的新型層析技術(shù)，解決了傳統(tǒng)生物分離工具載量低和工藝耗時(shí)問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)更快、更環(huán)保、更具成本效益的純化過(guò)程，完全符合當(dāng)今生物治療創(chuàng)新的需求。 西美杰是Astrea Bioseparations中國(guó)區(qū)代理，為用戶提供完善的技術(shù)支持與售后服務(wù)。歡迎隨時(shí)撥打西美杰客服熱線400-050-4006或登錄網(wǎng)站www.ahfanchi.com了解更多信息。 更多>

新年首發(fā) I Pfanstiehl 重磅推出注射級(jí)甘氨酸Glycine (G-140)

甘氨酸是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的氨基酸，學(xué)名氨基乙酸，分子式為C2H5NO2。常溫下是白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，味甜。它極易溶于水，在乙醇、丙酮這些有機(jī)溶劑里也能溶解，展現(xiàn)出較好的親水性。甘氨酸分子內(nèi)既有酸性羧基（-COOH），又有堿性氨基（-NH2)，這使其既能和酸反應(yīng)，也能與堿反應(yīng)，在不同的pH環(huán)境呈現(xiàn)出多樣的離子化狀態(tài)，緩沖能力出色。因其特點(diǎn)，甘氨酸在醫(yī)藥輔料制劑中應(yīng)用廣泛，并具有諸多優(yōu)勢(shì)，如以下應(yīng)用：緩沖劑： 甘氨酸分子的兩性離子特點(diǎn)，使其在不同的pH環(huán)境能穩(wěn)定溶液酸堿度，讓制劑環(huán)境維持穩(wěn)定，保障藥物活性成分不受酸堿性變動(dòng)影響，這對(duì)生物制品、酶類藥物等對(duì)pH敏感的藥物制劑極為關(guān)鍵。增溶劑：甘氨酸親水性良好，能夠和難溶性藥物分子相互作用，降低藥物分子之間的聚集，讓藥物以分子或離子態(tài)分散，增加其在溶劑里的溶解度，有助于難溶藥物制成溶液劑。 穩(wěn)定劑：在蛋白類、多肽類藥物制劑里，甘氨酸能夠優(yōu)先與周圍水分子結(jié)合，減少藥物分子的水化層干擾，防止藥物因聚集、變性而失活，能很好的維持這類生物大分子藥物的穩(wěn)定性。但甘氨酸在應(yīng)用于醫(yī)藥輔料時(shí)也有其局限性，如在應(yīng)用于凍干制劑時(shí)，容易發(fā)生結(jié)晶形態(tài)異常，在與其他輔料一同使用時(shí)，會(huì)改變整個(gè)凍干體系的塌陷溫度；在被用于調(diào)節(jié)注射劑滲透壓時(shí)，使用不當(dāng)會(huì)容易導(dǎo)致滲透壓過(guò)高等。尤其是，甘氨酸作為藥用輔料對(duì)純度要求極高，甘氨酸原料中的雜質(zhì)，哪怕是微量存在，進(jìn)入人體后也能引發(fā)免疫反應(yīng)或毒副作用。提純甘氨酸達(dá)到注射級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，技術(shù)難度大且成本高，所以一定程度限制了它在藥用制劑中的大規(guī)模應(yīng)用。Pfanstiehl秉承一貫高品質(zhì)理念，為滿足全球生物制藥行業(yè)對(duì)于高品質(zhì)甘氨酸的需求，隆重推出注射級(jí)甘氨酸Glycine (G-140), 具有超高純度，超低內(nèi)毒素，超低金屬殘留的特點(diǎn)，單獨(dú)檢測(cè)29種金屬離子，并且新增DNA，RNA，DNA酶，RNA酶和脂肪酶，亞硝酸鹽等多項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)的檢測(cè)，符合多國(guó)藥典規(guī)定（USP, EP, BP, JPE, ChP），可用于生物治療性藥物和疫苗的生產(chǎn)。 產(chǎn)品信息： · 產(chǎn)品名稱:Glycine, High Purity, Low Endotoxin, Low Metals, USP, EP, BP, JPE, ChP (G-140)· 中文名稱：甘氨酸· 分子式：C2H5NO2· 分子量：75.07 g / mol· CAS號(hào)：56-40-6· 產(chǎn)品貨號(hào)：G-140產(chǎn)品特點(diǎn)：· 超高純度，超低內(nèi)毒素，超低微生物含量，超低金屬雜質(zhì)殘留· 質(zhì)量指標(biāo)新增DNA，RNA，DNA酶，RNA酶，脂肪酶和亞硝酸鹽檢測(cè)· 符合多國(guó)藥典：USP, EP, BP, JPE, ChP· 符合ICH Q3D標(biāo)準(zhǔn)· 符合GMP標(biāo)準(zhǔn)· 美國(guó)DMF和中國(guó)CDE藥用輔料登記工作進(jìn)行中產(chǎn)品應(yīng)用：· 緩沖劑· 穩(wěn)定劑· 增溶劑如果您對(duì)Pfanstiehl注射級(jí)別Glycine G-140感興趣，歡迎聯(lián)系Pfanstiehl 中國(guó)區(qū)代理北京西美杰科技有限公司獲得如下詳細(xì)的產(chǎn)品概況說(shuō)明文件和測(cè)試樣品。 Pfanstiehl Inc.其他產(chǎn)品系列如下，歡迎聯(lián)系北京西美杰獲取100g裝免費(fèi)樣品。北京西美杰科技有限公司為Pfanstiehl中國(guó)代理，為客戶提供完善的技術(shù)支持與售后服務(wù)。歡迎撥打西美杰客服電話400-050-4006或者登陸網(wǎng)站www.ahfanchi.com了解更多信息。 更多>

【技術(shù)在線】HCP ELISA方法驗(yàn)證——加標(biāo)回收（Spike & Recovery）

前言 在ELISA試劑盒的使用過(guò)程中，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。為了有效識(shí)別樣品配方與試劑盒組分之間的兼容性，加標(biāo)回收這一關(guān)鍵驗(yàn)證試驗(yàn)顯得尤為重要。它不僅是評(píng)估ELISA試劑盒準(zhǔn)確性的重要工具，也是滿足法規(guī)和藥典（如ICH或FDA指南等）對(duì)商品化ELISA試劑盒方法學(xué)驗(yàn)證要求的可靠方式。 什么是加標(biāo)回收？ 加標(biāo)回收就是將已知量的標(biāo)準(zhǔn)品添加到樣品中（“加標(biāo)”，spiking），通過(guò)對(duì)比加入前后的檢測(cè)結(jié)果，評(píng)估“回收”（recovery）測(cè)量值的準(zhǔn)確性。這一過(guò)程可以揭示樣品及其緩沖液中某些成分是否會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果。目前，影響ELISA試劑盒定量結(jié)果的常見因素包括極端pH、去污劑、有機(jī)溶劑、高蛋白質(zhì)濃度以及高鹽濃度等。因此，在進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)之前，確保排除這些干擾因素是至關(guān)重要的。 如何判定干擾因素？ 樣品或緩沖液中的某些成分可能會(huì)影響HCP或其他雜質(zhì)的檢測(cè)與定量，導(dǎo)致回收結(jié)果的高估或低估，由此說(shuō)明樣品中存在干擾因素。同樣，上游收獲物和過(guò)程樣品的基質(zhì)中也可能存在疑似干擾 ELISA 檢測(cè)的成分。 在有干擾的情況下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通常表現(xiàn)為回收率偏低。但是，如果藥物本身或其他基質(zhì)組分與捕獲或檢測(cè)抗體有相互作用，則可能表現(xiàn)為回收率偏高。 此外，非特異性干擾，如試劑與孔板的結(jié)合，也會(huì)導(dǎo)致OD值偏高。通過(guò)合理控制實(shí)驗(yàn)流程，可以找出具體的干擾因素。 何時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)？ 在進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)前，需要先完成樣品的稀釋線性分析，只有明確了最低需求稀釋倍數(shù)（MRD），加標(biāo)回收分析才有意義。（稀釋線性分析的詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參考《HCP ELISA方法驗(yàn)證——稀釋線性dilution linearity》） （Tips：每種類型的樣品基質(zhì)都需要進(jìn)行加標(biāo)回收分析。同時(shí)如果實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行了優(yōu)化，則需要重復(fù)此實(shí)驗(yàn)以確保檢測(cè)的有效性。） 如何執(zhí)行加標(biāo)回收分析？ 樣品制備： 加標(biāo)樣品：可以設(shè)定3-4個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入到不同類型待檢樣品中，制備成加標(biāo)樣品，需要注意的是加標(biāo)樣品的濃度需在滿足MRD的條件下進(jìn)行分析，也就是最低加標(biāo)濃度不能低于LOQ的兩倍。 對(duì)照樣品：按相同體積比在每種待檢樣品中加入樣品稀釋液，制備成對(duì)照樣品，用于測(cè)定樣品本底的HCP濃度。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程： 使用ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)加標(biāo)樣品和對(duì)照樣品，每個(gè)樣品最好做3個(gè)重復(fù)孔，以計(jì)算均值。 結(jié)果分析： 回收率計(jì)算公式： 如下表案例所示，我們使用大腸桿菌HCP ELISA試劑盒（F410）分別檢測(cè)加標(biāo)樣品（100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品與樣品按1:4體積比混合，加標(biāo)濃度為20 ng/mL）和對(duì)照樣品（樣品稀釋液與樣品按1:4體積比混合），通過(guò)測(cè)得的HCP濃度計(jì)算出回收率為95%。依據(jù)ICH、FDA及EMA等分析方法驗(yàn)證指南要求，HCP加標(biāo)回收率的可接受范圍應(yīng)在75%~125%。 為了方便您快速了解如何用4倍稀釋法制備加標(biāo)樣品和ELISA布板的詳細(xì)步驟，請(qǐng)觀看以下操作視頻。加標(biāo)回收問(wèn)題排查 如果加標(biāo)回收數(shù)據(jù)顯示出明顯的產(chǎn)物或基質(zhì)干擾，您可能需要通過(guò)進(jìn)一步稀釋樣品或置換緩沖液等方式來(lái)獲取準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。理想情況下，請(qǐng)選擇與標(biāo)準(zhǔn)品相同的稀釋液進(jìn)行樣品稀釋，這樣可以最大限度地減少偏差。在某些情況下，調(diào)整檢測(cè)方法也許能提高特定樣品類型的準(zhǔn)確性，但請(qǐng)務(wù)必謹(jǐn)慎操作，以免影響結(jié)果的可靠性。 為了全力支持客戶進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證及方法學(xué)開發(fā)，Cygnus為每款ELISA試劑盒都配備了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，詳情請(qǐng)查閱下表。貨號(hào)品名規(guī)格適用的試劑盒貨號(hào)F553H-1CHOHCP Antigen Concentrate, 3G400 µlF550-1F1048XCHO Lysate HCP AntigenConcentrate200 uLF1045F1023XE.coli HCP 2G Antigen Concentrate200 uLF1020F1063XBL21(DE3) HCP AntigenConcentrate200 µlF1060F653SXHEK293 Antigen Concentrate250 µlF650SF1043XSf9 HCP 3G AntigenConcentrate200 µlF1040F1018XP.pastoris HCP Antigen Concentrate200 µlF1015F143UP. pastoris AntigenConcentrate200 µlF140/F640F978XVeroCell 2G HCP Antigen Concentrate400 µlF975F1058XPER.C6 HCP 2G AntigenConcentrate200 µlF1055F1033XSP2/0HCP 2G Antigen Concentrate200 uLF1030F998XPG13 HCP AntigenConcentrate200 uLF995F493GL.lactis HCP Antigen Concentrate 200 µlF490F233GA549 Antigen Concentrate200 µlF230F813XHeLaAntigen Concentrate1 mlF810F803XMDCK Antigen Concentrate1 mlF800F513GBHKHCP Antigen Concentrate1 mlF510F227CNS/0 Antigen Concentrate1 mlF220F453XP.fluorescens Antigen Concentrate1 mlF450F823XCAP® Antigen Concentrate400 µlF820F1028XC1HCP Antigen Concentrate200 uLF1025F603XProtein A AntigenConcentrate250 µlF600F613XProteinA Antigen Concentrate250 µlF610F403HProtein A AntigenConcentrate200 µlF400F044ProteinA Concentrate200 µlF050/F050HF740-CAmsphere? A3 Ligand Protein A Control250 µlF740F968XAvantorJ.T.Baker® BAKERBOND® PROchievA? Protein A Antigen Concentrate250 µlF965F743XAmsphere? A3 Ligand Protein A Antigen Concentrate300 µlF740F1068XProteinL Antigen Concentrate200 µlF1065F963XEndonucleaseGTP® AntigenConcentrate500 µlF960F031GBSAAntigen Concentrate1 mlF030雖然加標(biāo)回收可以驗(yàn)證HCP ELISA的準(zhǔn)確性，但這只是整體方法學(xué)驗(yàn)證的一部分。完整的驗(yàn)證過(guò)程仍需包括精密度、LOD、LLOQ、ULOQ和HCP抗體覆蓋率等分析。Cygnus針對(duì)每一種檢測(cè)試劑盒均提供相應(yīng)的QS（Qualification Summary）文件，如有需求歡迎點(diǎn)擊這里填寫信息索取，或直接聯(lián)系Cygnus中國(guó)總代理西美杰。如您在使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的過(guò)程中遇到任何問(wèn)題，我們的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)將竭誠(chéng)為您提供解決方案和建議。Cygnus Technologies專注為生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法超過(guò)25年，旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量。Cygnus開發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒，用于檢測(cè)超過(guò)50種不同表達(dá)系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專注于生物技術(shù)應(yīng)用免疫檢測(cè)的高靈敏度分析技術(shù)的專家，其產(chǎn)品和服務(wù)已經(jīng)被全球超過(guò)95%以上生物制藥公司使用，并獲得FDA、NMPA、EMA等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的廣泛認(rèn)可。北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國(guó)總代理，與國(guó)內(nèi)眾多知名藥企，CRO/CMO企業(yè)建立了長(zhǎng)久穩(wěn)定的合作關(guān)系。多年來(lái)西美杰的產(chǎn)品及服務(wù)幫助許多企業(yè)加速R&D階段，提高藥物質(zhì)量、純度和安全，加速優(yōu)化研發(fā)工藝，減少產(chǎn)品上市時(shí)間，降低QC成本。如您對(duì)上述產(chǎn)品感興趣，歡迎致電西美杰客服熱線400-050-4006或者登陸網(wǎng)站www.ahfanchi.com了解更多信息。 更多>

新品上市 | 舟帆生物IEC-HPLC通用流動(dòng)相

前言 離子交換色譜法是一種重要的生物化學(xué)分離技術(shù)，它基于帶電分子與固定相之間的相互作用，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析，使得通過(guò)酸堿變體推導(dǎo)蛋白相關(guān)降解途徑成為可能，并為相關(guān)的質(zhì)量控制和分子優(yōu)化提供指導(dǎo)數(shù)據(jù)。而在蛋白質(zhì)分析過(guò)程中，離子交換色譜法方法開發(fā)是非常困難的,這受困于每個(gè)蛋白的空間結(jié)構(gòu)和氨基酸排列截然不同，這種跳躍式的變化使得每種蛋白擁有不同的等電點(diǎn)與唾液酸或糖基化程度，這大大增加相關(guān)方法開發(fā)的困難程度，此開發(fā)的關(guān)鍵步驟包括多步：選擇合適的離子交換介質(zhì)、優(yōu)化緩沖體系、確定洗脫條件、調(diào)整流速和柱溫等。這些步驟確保了離子交換色譜法在蛋白質(zhì)分析中的有效性和可靠性，但繁瑣的方法開發(fā)步驟也為試驗(yàn)帶來(lái)極大的時(shí)間成本，間接的增加投入成本，且伴隨著方法開發(fā)失敗的風(fēng)險(xiǎn)，這成為蛋白藥物分析領(lǐng)域迫在眉睫的問(wèn)題。舟帆生物已經(jīng)開發(fā)出關(guān)于離子交換色譜法的通用流動(dòng)相，并取得了令人鼓舞的進(jìn)展。由于樣品中各組分的電荷性質(zhì)、大小、形狀和疏水性等都會(huì)影響離子交換色譜的過(guò)程和結(jié)果，選擇合適的離子交換介質(zhì)和緩沖體系尤為重要。離子強(qiáng)度、pH值、溫度和流速等色譜條件的優(yōu)化需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，并且離子交換色譜法中離子強(qiáng)度和pH值的微小變化都可能導(dǎo)致分離效果的顯著差異。在日常配制關(guān)于離子交換色譜法流動(dòng)相時(shí)精確控制這些參數(shù)是實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定和重復(fù)性分離的關(guān)鍵。然而，在實(shí)際操作中，由于緩沖液的制備和使用過(guò)程可能會(huì)引入誤差，通常導(dǎo)致色譜峰保留時(shí)間的遷移等問(wèn)題。為了解決上述問(wèn)題，舟帆生物自主開發(fā)并優(yōu)化出了一款用于離子交換色譜法的通用流動(dòng)相，該產(chǎn)品綜合考慮了分析成本和時(shí)間效率，在離子色譜方法開發(fā)過(guò)程中兼具了分離效率、分析時(shí)間和成本，提供了一種高效、經(jīng)濟(jì)且通用的離子交換色譜流動(dòng)相的選擇。 材料與方法 儀器、色譜柱 安捷倫1260 高效液相色譜系統(tǒng)ThermoProPac? WCX-10 HPLC 10μm 4×250mm色譜柱樣品 實(shí)驗(yàn)中用到的樣品包括8個(gè)蛋白藥物樣品均來(lái)自合作方浙江大學(xué)藥學(xué)院生物藥制劑與分析團(tuán)隊(duì)。IEC-HPLC參數(shù) 下表列出了使用ZF-LC-0002流動(dòng)相A&B（10×）進(jìn)行IEC-HPLC液相分析的色譜參數(shù)：實(shí)驗(yàn)參數(shù) 將8種蛋白稀釋到1mg/mL,并使用CpB酶酶切，酶切后的樣品10000 rmp/min離心十分鐘取上清液進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果 見圖1。圖1. 8 種蛋白藥物的IEC-HPLC 色譜圖 結(jié)論 開發(fā)出一種離子交換色譜法通用的流動(dòng)相，在8種蛋白藥物樣品的分析中使用簡(jiǎn)單的洗脫條件即可對(duì)蛋白分子的酸性變體和堿性變體達(dá)到較好的分離，為離子交換色譜法相關(guān)的方法開發(fā)提供了一項(xiàng)優(yōu)異選項(xiàng)，可以為企業(yè)和相關(guān)研究單位大大縮短方法開發(fā)時(shí)間和投入。產(chǎn)品訂購(gòu)信息 貨號(hào) 品名 規(guī)格 ZF-LC-0002IEC-HPLC通用流動(dòng)相（10×）盒（含A液、B液各1000mL) 試用申請(qǐng) IEC-HPLC通用流動(dòng)相試用裝火熱申請(qǐng)中，如您對(duì)上述產(chǎn)品感興趣，請(qǐng)關(guān)注“西美杰微信公眾號(hào)”，發(fā)送關(guān)鍵詞“IEC”，填寫問(wèn)卷即可獲得免費(fèi)試用機(jī)會(huì)，數(shù)量有限，先到先得！品牌介紹 杭州舟帆生物科技有限公司成立于2018年，擁有一支高效的研發(fā)團(tuán)隊(duì)，是一家專注于生物科技領(lǐng)域的公司。公司在蛋白質(zhì)藥品工藝開發(fā)和優(yōu)化、分子診斷等領(lǐng)域擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)優(yōu)勢(shì)。我們的產(chǎn)品包括商業(yè)化毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)試劑盒、高效液相色譜離子交換檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)試劑、分子診斷試劑等。這些產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、藥物開發(fā)等領(lǐng)域，與眾多知名研究機(jī)構(gòu)和企業(yè)建立了緊密的合作關(guān)系，共同推動(dòng)生物科技的發(fā)展和應(yīng)用。北京西美杰科技有限公司是舟帆生物總代理，始終秉承著專業(yè)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。如果您對(duì)上述產(chǎn)品感興趣，歡迎致電北京西美杰客服熱線400-050-4006或登錄網(wǎng)站www.ahfanchi.com了解更多產(chǎn)品信息。 更多>

抗體親和提取(AAE?)：革新宿主細(xì)胞蛋白(HCPs)分析的新篇章

在生物制藥領(lǐng)域，對(duì)宿主細(xì)胞蛋白(HCPs)的精準(zhǔn)分析與控制是確保藥物安全與有效性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。各國(guó)法規(guī)都有關(guān)于HCPs的論述，要求必須對(duì)生物藥品進(jìn)行分析和純化，以將宿主細(xì)胞蛋白HCPs降低到可接受的水平。 不同監(jiān)管機(jī)構(gòu)宿主細(xì)胞蛋白(HCPs)法規(guī)要求: 《中國(guó)藥典》(2020版)三部規(guī)定：針對(duì)CHO細(xì)胞，HCPs殘留需要<0.05%(相當(dāng)于小于500ppm)；針對(duì)E.coli，HCP殘留需要<0.01%。 美國(guó)藥典USP<1132>章節(jié)規(guī)定：用一種靈敏度較高的方法檢測(cè)藥品中的HCPs，其含量應(yīng)該低于檢測(cè)限(通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCPs含量應(yīng)小于100ng，也即<0.01%)。 歐洲藥典EP 2.6.34中規(guī)定：在生物制品中，HCP的含量應(yīng)當(dāng)小于0.1%。 國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)指南：ICH Q6B指出，需要根據(jù)ICH準(zhǔn)則采用敏感且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的有效方法來(lái)監(jiān)控殘留的HCPs，其殘留量通常要求小于100ppm。ELISA是各國(guó)藥典推薦的在生物制品中檢測(cè)殘留HCPs的方法，可以測(cè)定HCPs的總量。并且ELISA的操作簡(jiǎn)便，是經(jīng)典的免疫學(xué)檢測(cè)方法。但ELISA檢測(cè)HCPs也有方法的局限性，比如不能從ELISA的結(jié)果中知道樣品中有哪些HCPs，或者用于檢測(cè)的抗體與哪些HCPs發(fā)生了免疫反應(yīng)。因此，監(jiān)管部門要求在使用ELISA檢測(cè)過(guò)程中HCPs殘留含量時(shí)，不僅要通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證證明試劑盒的準(zhǔn)確度，精密度，靈敏度等，而且還需要證明使用的HCPs抗體有廣泛的反應(yīng)性，即HCPs抗體覆蓋率。圖 1 HCP ELISA試劑盒檢測(cè)流程 什么時(shí)候做HCPs抗體覆蓋率驗(yàn)證？ 美國(guó)藥典USP<1132>和歐洲藥典EP2.6.34. HOST-CELL PROTEIN ASSAYS將HCPs檢測(cè)方法分為：商業(yè)化試劑盒、產(chǎn)品/工藝專屬性方法和平臺(tái)化方法。并指出在產(chǎn)品開發(fā)的不同階段，推薦采用不同的ELISA試劑盒用于HCPs的檢測(cè)。 USP<1132>提到在沒有平臺(tái)化方法的情況下可以在臨床前、臨床I期、II期使用商品化試劑盒；在臨床III期/工藝驗(yàn)證及產(chǎn)品上市后，由于商業(yè)化的通用HCP檢測(cè)試劑盒抗體的覆蓋率往往不足等局限性，需要考慮結(jié)合細(xì)胞類型及工藝特異性等因素，使用平臺(tái)化方法或針對(duì)上游工藝開發(fā)的產(chǎn)品/工藝專屬性方法。 而在臨床II期后若是需要繼續(xù)使用商品化試劑盒，就需進(jìn)行HCPs抗體覆蓋率驗(yàn)證來(lái)評(píng)估試劑盒是否可以繼續(xù)用于質(zhì)量監(jiān)控。通常推薦在臨床II期末或者臨床三期前的這個(gè)階段去做覆蓋率驗(yàn)證，此時(shí)生產(chǎn)工藝已經(jīng)固定并且有相對(duì)充足的時(shí)間。 圖2 USP <1132>產(chǎn)品開發(fā)的不同階段HCP檢測(cè)方法的建議 HCP覆蓋率驗(yàn)證的不同技術(shù)路線 傳統(tǒng)的分析方法采用2D Western blot進(jìn)行覆蓋率驗(yàn)證，是基于等電點(diǎn)和分子量不同的原理，蛋白在凝膠上通過(guò)SDS-PAGE方法被分離。其中一張膠被銀染，另一張被轉(zhuǎn)到PVDF膜上，并結(jié)合ELISA試劑盒中的抗體進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)。但因其固有的方法學(xué)限制和技術(shù)挑戰(zhàn)，往往難以全面、準(zhǔn)確地評(píng)估多克隆抗體對(duì)HCPs的覆蓋范圍。 2D WB方法限制因素： 負(fù)載能力低 樣品經(jīng)過(guò)前處理會(huì)破壞蛋白天然表位 HCPs結(jié)合到PVDF膜上導(dǎo)致?lián)p失部分檢測(cè)到的抗體信息 難以完全將PAGE凝膠與WB圖片對(duì)齊 特異性差，顯著低估真實(shí)抗體覆蓋率 為了克服這一難題，Cygnus Technologies于2014年創(chuàng)新性地推出了抗體親和提取(Antibody Affinity Extraction，AAE?)技術(shù)，目的是提高細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中總HCPs混合物的靈敏度和覆蓋率評(píng)估，并可以檢測(cè)對(duì)下游工藝特異性HCPs的反應(yīng)性，這些通常也是最為關(guān)注的HCPs。與2D-PAGE和2D-WB的靈敏度受負(fù)載能力等限制不同，AAE?的靈敏度可高出100倍以上，因?yàn)樗軌蛱崛『蜐饪s大量樣品。 表 1 AAE與2D-WB覆蓋率技術(shù)路線對(duì)比 AAE 2D-WB 靈敏度 可富集mg級(jí)HCPs 靈敏度高(>95%) 因WB方法的局限性，覆蓋率被低估 靈敏度低(50-70%) 特異性 無(wú)變性處理特異性高(>99.5%) 抗原變性處理后特異性結(jié)合低(50-80%) 覆蓋率 AAE+2D-PAGE 60-90% AAE-MS 70-95% 50-70% 適用性 純化前和純化后均可 只是適合純化前樣品 AAE分析流程首先將多克隆抗體共價(jià)固定在色譜柱上。然后對(duì)色譜柱進(jìn)行條件調(diào)節(jié)，以防止抗體的顯著浸出并極大地減少任何非特異性結(jié)合。原始未變性的HCPs樣品通過(guò)色譜柱與抗體進(jìn)行結(jié)合，隨后用酸洗脫。通過(guò)結(jié)合和洗脫，HCPs樣品再次在柱上循環(huán)，直到?jīng)]有其他HCPs被結(jié)合。所有收集的HCPs洗脫液再匯集、交換緩沖液并濃縮回原始樣品體積，為后續(xù)的分析提供高質(zhì)量的樣本。在收集到HCPs樣本后，可以選擇通過(guò)2D-PAGE+銀染或MS質(zhì)譜進(jìn)行后續(xù)分析。 圖3 USP <1132>產(chǎn)品開發(fā)的不同階段HCP檢測(cè)方法的建議 抗體對(duì)下游HCPs的反應(yīng)性和AAE-MS?的HCPs鑒定 AAE?技術(shù)的優(yōu)勢(shì)不僅在于其高靈敏度，更在于其強(qiáng)大的預(yù)測(cè)能力和廣泛的應(yīng)用前景。通過(guò)AAE-MS?獲得的覆蓋率的結(jié)果更高、更真實(shí)，可以更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)抗HCPs抗體在ELISA中的表現(xiàn)。并且，AAE?與質(zhì)譜聯(lián)用(AAE-MS?)能夠識(shí)別收獲材料中與抗體反應(yīng)的HCPs，并獲得蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)(pI)信息，可以評(píng)估純化過(guò)程中持續(xù)存在的單個(gè)HCPs，并優(yōu)化下游純化工藝。 圖4 F650S HEK2 93抗體覆蓋率驗(yàn)證 值得一提的是，AAE?技術(shù)在檢測(cè)并證明對(duì)單個(gè)下游HCP的反應(yīng)性方面表現(xiàn)出色。更主要的是質(zhì)譜可以對(duì)樣品中是否存在潛在高風(fēng)險(xiǎn)的HCPs做出鑒定并提供這些蛋白的注釋信息。通過(guò)AAE?技術(shù)，能夠更準(zhǔn)確地識(shí)別和量化這些高風(fēng)險(xiǎn)HCPs。這些通過(guò)特定純化過(guò)程持續(xù)存在的高風(fēng)險(xiǎn)HCPs對(duì)于患者安全、藥物功效和穩(wěn)定性至關(guān)重要，無(wú)論是藥物研發(fā)人員還是監(jiān)管人員都能通過(guò)這一技術(shù)清楚地了解工藝中某個(gè)HCP的殘留情況，從而為藥物的研發(fā)和生產(chǎn)提供強(qiáng)有力的支持。 表 2 CHO細(xì)胞高風(fēng)險(xiǎn)HCPs 高風(fēng)險(xiǎn)蛋白（CHO） PRE F550 F550-1 pl MW 78 kDa glucose regulated protein (BiP,HSPA5) N Y Y 5.07 72379.1 Cathepsin B(CTSB) Y Y Y 5.73 35646.9 Cathepsin D Y Y Y 6.54 44110.9 Cathepsin E N N N 4.61 42726.4 Clusterin Y Y Y 5.58 51557.5 Glutathione S transferase P N Y Y 7.64 23638.2 Matrix Metalloproteinase 19 Y Y Y 7.71 58942 Monocyte chemoattractant protein 1(MCP-1) Y Y Y 9.32 15858.4 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase Y Y Y 9.59 23634.4 …. AAE-MS?在藥物原液和過(guò)程樣品監(jiān)控中的應(yīng)用 AAE-MS?也可以對(duì)藥物原液中HCPs富集的同時(shí)去除了大部分原料藥。去除原料藥極大地提高了通過(guò)2D-PAGE和質(zhì)譜分析識(shí)別單個(gè)HCPs的能力，因?yàn)樗幤吠ǔＲ?04-106的倍數(shù)掩蓋HCPs。AAE-MS?是一種更客觀和直接的方法檢測(cè)和鑒定原料藥中任何潛在的HCPs雜質(zhì)以幫助優(yōu)化下游純化工藝。 圖5 AAE對(duì)藥物原液中HCPs的富集 圖6 AAE-MS?對(duì)藥物原液中高風(fēng)險(xiǎn)HCPs的富集和鑒定總之，抗體親和提取(AAE?)技術(shù)以其卓越的性能和廣泛的應(yīng)用前景，正在逐步成為生物制藥領(lǐng)域HCPs分析的新標(biāo)準(zhǔn)。它不僅能夠克服傳統(tǒng)方法的局限性，更在靈敏度、預(yù)測(cè)能力和應(yīng)用深度上實(shí)現(xiàn)了顯著提升。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，相信AAE?將在未來(lái)為更多藥物的研發(fā)和生產(chǎn)貢獻(xiàn)力量，為患者帶來(lái)更加安全、有效的治療方案助力。 支持文獻(xiàn) [1] USP <1132> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals. [2] USP <1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry. [3] EP-2.6.34. Host-Cell Protein Assays. [4] Host Cell Protein Analysis: Immunoassays and Orthogonal Characterization By Antibody Affinity Extraction and Mass Spectrometry Methods [5] Antibody Affinity Extraction (AAE?) - A superior alternative to 2D Western blot for determination of polyclonal anti-HCP reactivity. [6] Antibody Affinity Extraction (AAE?) Empowers HCP Identification by Mass Spectrometry. 更多>

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